PEWARNAAN GRAM

Laporan Praktikum 6 Mikrobiologi Nutrisi	Hari, Tanggal Tempat		: Senin, 16 April 2018 : Laboratorium Biokimia, Fisiologi, dan Mikrobiologi Nutrisi.
	Asisten		: Retno Palupi  /D24140004

 
                                                          

PEWARNAAN GRAM

Irvan Triansyah

D24160115

Kelompok 4 / G2

DEPARTEMEN ILMU NUTRISI DAN TEKNOLOGI PAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2018

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Hewan ruminansia memiliki lambung yang kompleks. Salah satu lambung tersebut yaitu rumen. Peran rumen sangat penting sekali dalam pengolahan zat makanan ruminansia terutama zat makanan hijauan. Hijauan akan dapat dimanfaatkan jika dan hanya jika rumen berfungsi sempurna dalam mengubah selusosa atau hemiselulosa menjadi senyawa VFA. Beberapa mikroba merupakan agen pengubah hal tersebut didalam rumen tetapi beberapa mikroba dalam rumen tidak mampu mengubah zat makanan tersebut menjadi VFA, yang berarti ada yang menguntungkan dan ada yang merugikan. Cara mengetahui mikroba yang menguntungkan dan merugikan dapat kita lakukan dengan pewarnaan gram (Sujaya et al. 2008).

Pewarnaan gram merupakan suatu metode untuk membedakan suatu bakteri berdasarkan struktur dinding selnya. Prinsip pewarnaan gram yaitu pemberian warna kristal violet dan safranin dimana pada bakteri positif gram akan bewarna ungu sedangkan untuk bakteri negatif gram akan bewarna merah. Fungsi pewarnaan gram hampir selalu digunakan sebagai langkah pertama dalam mendiagnosis bakteri, memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk mikroba, melihat struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, dan menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari mikroba dengan zat warna. Hal ini lah yang mendasari praktikum pewarnaan gram pada mikroba cairan rumen (Endriani et al. 2010).

Tujuan

Praktikum ini bertujuan melihat perbedaan morfologi bakteri gram positif dan bakteri gram negatif pada cairan rumen.

TINJAUAN PUSTAKA

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram adalah teknik yang cepat dan digunakan untuk melihat adanya bakteri dalam sampel jaringan dan untuk menggolongkan bakteri tersebut sebagai Gram-positif atau Gram-negatif, berdasarkan sifat-sifat kimiawi dan fisik dinding selnya. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri (Meidira et al. 2017).

Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif

Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak. Bakteri garam positif  merupakan bakteri yang mengikat warna utama (Crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel mikroba tampak berwarna ungu. Bakteri gram negatif  merupakan bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan oleh  peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah (Pratiwi 2008).

Jenis dan Morfologi Bakteri Rumen Positif dan Negatif

Bakteri selulolitik yang mempunyai kemampuan untuk memecah selulosa dan mampu bertahan pada kondisi yang buruk pada saat makanan yang mengandung serat kasar yang tinggi. Bakteri proteolitik mempunyai kemampuan untuk memecah protein, asam amino, dan peptida menjadi ammonia dan bias merugikan karena sebagian asam amino digunakan untuk sumber energi mereka. Bakteri methanogenic merupakan bakteri yang dapat mengkatabolisasi alkohol dan asam organik menjadi methan dan karbondioksida. Bakteri amilolitik merupakan bakteri yang dapat memfermentasikan amilum. Bakteri yang memfermentasikan gula, bakteri lipolitik yang merupakan bakteri rumen yang dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan asam lemak, bakteri pemanfaat asam, dan bakteri hemiselulotitik merupakan bakteri gram positif (Saropah et al. 2013).

Tidak semua jenis protozoa mempunyai aktivitas selulolitik atau berpengaruh positif terhadap kecernaan serat. Ada protozoa yang berpengaruh negatif dalam sistem pencernaan rumen. Protozoa dari sub-kelas holotrich dan Isotricha sp. menyebabkan penurunan pH rumen dan mengganggu pencernaan pakan berserat. Protozoa Entodinium berpengaruh positif terhadap pencernaan pakan berserat. Banyak Holotrichia dan Oligotrichia secara aktif memakan bakteri di dalam rumen. Spesies protozoa di dalam rumen berubah tergantung pada makanan rumiansia, musim, dan lokasi geografis. Keberadaan protozoa dalam rumen sering mengganggu ekosistem bakteri, karena mempunyai sifat memangsa bakteri dan secara negatif mempengaruhi proses pencernaan serat pakan (Febriansyah 2011). Struktur dinding sel fungi dan komposisinya mirip bakteri gram negatif. Organisme ini dinamakan sebagai Oscillospira guillermondii dan hanya terdapat dalam rumen (Kumala dan Pratiwi 2014).

MATERI DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu syring, spoit, objek glass, spidol, Bunsen, korek api, mikroskop, gelas arloji, dan tissue. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu pewarna Kristal violet, safranin, I₂ dalam KI, minyak imersi, alkohol 95%, media bakteri rumen, akuadest, dan alkohol 70%.

Metode

Praktikan dan tempat disterilisasi menggunakan alkohol 70% serta dilap menggunakan tissue. Bunsen disiapkan untuk dilakukan selama proses pewarnaan gram. Objek glass disterilisasi menggunakan alkohol 70% dan dilap menggunakan tissue lalu di buat lingkaran dengan menggunakan spidol permanen pada bagian belakang objek glass untuk memberikan pembatas pengamatan. Syring diambil dan dibersihkan. Tutup atau bagian mulut tabung reaksi yang berisikan rumen dibersihkan. Proses tersebut dilakukan didekat bunsen yang menyala.  Cairan rumen diambil dan dioleskan diatas objek glass lalu diratakan seluas lingkaran pembatas tadi. Objek glass yang sudah berisi olesan cairan rumen difiksasi agar cairan rumen menempel di objek glass, usahakan jangan terlalu menyentuh api agar dinding sel tidak pecah. Kristal violet diberikan pada objek glass selama 1 menit. Objekglass disiram dengan akuadest secara merata sampai warna ungu hilang. I₂ dalam KI diteteskan agar pewarnaan lebih jelas selama 2 menit. Objek glass disiram menggunakan alkohol 95% hingga warna hilang lalu disiram akuadest. Safranin diberikan sebagai pemberi warna merah selama 2 menit. Akuadest diberikan dan tekan-tekan dengan perlahan objek glass menggunakan tissue. Objek glass diamati dibawah mikroskop.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Berikut hasil pengamatan pewarnaan gram positif dan negatif pada cairan bakteri rumen dibawah mikroskop dengan perbesaran seratus.

Gambar 1 bakteri gram positif yang terdapat dalam cairan rumen dengan perbesaran 100 kali.

Gambar 2 bakteri gram negatif yang terdapat dalam cairan rumen dengan perbesaran 100 kali.

Gambar 3 kiri bakteri gram positif dan kanan bakteri gram negatif yang terdapat.

Sumber : https://id.wikihow.com/Melakukan-Pewarnaan-Metode-Gram

Pembahasan

Pewarnaan gram merupakan suatu metode untuk membedakan suatu bakteri berdasarkan struktur dinding selnya. Prinsip pewarnaan gram yaitu pemberian warna kristal violet dan safranin dimana pada bakteri positif gram akan bewarna ungu sedangkan untuk bakteri negatif gram akan bewarna merah. Fungsi pewarnaan gram hampir selalu digunakan sebagai langkah pertama dalam mendiagnosis bakteri, memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk mikroba, melihat struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, dan menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari mikroba dengan zat warna (Meidira et al. 2017).

Pewarnaan gram pada media rumen yaitu akan menghasilkan warna ungu atau biru pada mikroba gram positif. Bakteri selulolitik Bakteri proteolitik Bakteri methanogenic Bakteri amilolitik, Bakteri memfermentasikan gula, bakteri lipolitik, bakteri pemanfaat asam, bakteri hemiselulotitik merupakan bakteri gram positif. Warna merah pada mikroba gram negaif. Protozoa dari sub-kelas holotrich dan Isotricha sp. menyebabkan penurunan pH rumen dan mengganggu pencernaan pakan berserat. Protozoa Entodinium berpengaruh positif terhadap pencernaan pakan berserat. Banyak Holotrichia dan Oligotrichia secara aktif memakan bakteri di dalam rumen. Fungi struktur dinding sel dan komposisinya mirip bakteri gram negatif. Organisme ini dinamakan sebagai Oscillospira guillermondii (Pratiwi 2008).

Hasil yang diperoleh saat praktikum pada gambar 1 menunjukan mikroba gram positif bewarna ungu berbentuk bulat berkoloni beraturan membentuk lingkaran. Hal ini sesuai dengan Utama et al. (2013) bakteri gram positif antara lain Streptococcus thermophilus, Strepthococcus cremoris yang semuanya  ini adalah bakteri gram positif berbentuk bulat (coccus). Gambar 2 menunjukan mikroba gram negatif bewarna merah bulat-bulat berkoloni tak beraturan. Hal ini sesuai dengan Anggraini (2015) bakteri gram negatif berbentuk coccus adalah bakteri selulolitik. Kesalahan biasanya terjadi karena ”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-positif dapat menjadi Gram negatif.

            Fungsi Alkohol 95% berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri (Huda 2017). I₂ dalam KI merupakan Iodin yang dilarutkan dengan KI akan menyebabkan terbentuk larutan yang mengandung ion Triodida. Ion triodida ditambahkan ke dalam air + amilum, maka hasil warna larutan tersebut menjadi merah tua pekat dan agak encer. Padahal seharusnya campuran tersebut berwarna biru tua . Iodida mudah dioksidasi dalam larutan asam menjadi iod bebas dengan sejumlah zat pengoksidasi iod bebas ini lalu bisa diidentifikasi dari pewarnaan biru-tua yang dihasilkannya dengan larutan kanji (Febrianti et al 2016). Safranin adalah pemberian zat penutup (counter stain). Safranin juga merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna sekunder, zat ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna utama, dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non-target. Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan luruhnya kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negative (Mubarak et al. 2016). Kristal violet merupakan reagen berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna ungu. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda (Desmara et al. 2017)

SIMPULAN

Pewarnaan gram berguna untuk mengklasifiasikan jenis mikroba yang menguntungkan dan merugikan. Biasanya gram positif bewarna ungu atau biru mendapati peran mendukung dalam proses pencernaan dalam rumen sebaliknya gram negatif mendapati peran tidak mendukung dalam proses pencernaan dalam rumen kecuali pada fungi yang memang morfologinya seperti gram negatif.

DAFTAR PUSTAKA

.

Anggraini AL. 2015. Isolasi dan skrining bakteri Indigenous dari air rendaman pelepah tanaman salak (Zalacca edulis) yang berpotensi sebagai bakteri selulolitik [skripsi]. Surakarta (ID): Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Desmara S, Rezeki S, Sunnati. 2017. Konsentrasi hambat minuman dan konsentrasi bunuh minuman ekstrak daun kemangi (Ocimum sanctum L.) terhadap pertumbuhan Candida albicans. Journal Caninus Dentistry. 2(1):31-39.

Endriani R, Andrini F, Alfina D. 2010. Pola resistensi bakteri penyebab infeksi saluran kemih terhadap antibakteri di Pekanbaru. Jurnal Natur Indonesia. 12(2): 130-135.

Febriansyah RA. 2011. Uji viabilitas konsorsium bakteri biodekomposer selama dua bulan guna menentukan umur inokulum yang optimal [skripsi]. Malang (ID): Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang.

Febrianti N, Rohmana IR, Yunianto I, Putri RD. 2016. Perbandingan aktivitas antioksidan buah pepaya (Carica papaya L.) dan buah jambu biji merah (Psidium guajava L.). Jurnal Biologi. 2(11): 17-24.

Huda WAK. 2017. Pemberian aditif air kelapa, rebusan daun sirih, dan campurannya terhadap lemak darah ayam broiler [skripsi]. Semarang (ID): UNDIP.

Kumala S, Pratiwi AA. 2014. Efek antimikroba dari kapang endofit ranting tanaman biduri. Jurnal Farmasi Indonesia. 7(2): 111-120.

Meidira S, Darmawati S, Wilson W. 2017. Identifikasi Vibro cholerae pada kerang hijau (Perna viridis) yang dijual di tambak lorok Semarang [tesis]. Semarang (ID): UNIMUS.

Mubarak Z, Chismirna S, Daulay HH. 2016. Aktivitas antibakteri ekstrak propolis alami dari sarang lebah terhadap pertumbuhan Enterococcus faecalis. Journal Of Syiah Kuala Dentistry Society. 1(2): 175-186.

Pratiwi SI. 2008. Aktivitas antibakteri tepung daun jarak (Jatropha curcas L.) pada berbagai bakteri saluran pencernaan ayam broiler secara in vitro. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Saropah DA, Jannah A, Maunatin A. 2013. Kinetika reaksi enzimatis ekstrak kasar enzim selulase bakteri selulolitik hasil isolasi dari bekatul. Jurnal Alchemy. 2(1): 34-45.

 Sujaya N, Romana Y, Widarini NP, Suariani NP, Dwipayanti NMU, Nocianitri KA, Nursini NW. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari susu kuda sumbawa. Jurnal Veteriner. 9(2): 52-59.

Utama CS, Sulistyanto B, Setiani BE. 2013. Profil mikrobiologis pollard yang difermentasi dengan ekstrak limbah pasar sayur pada lama peram yang berbeda. Jurnal Agripet. 13(3): 35-46